西安细胞自噬透射电镜
细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、观察自噬体的形成:由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成:由于电镜耗时长,不利于监测自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。自噬体形成依赖于一系列ATG蛋白在蛋白泛素化过程中的共价结合。西安细胞自噬透射电镜
细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。(注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)2、检测长寿蛋白的批量降解:非特异。3、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。4、CellTrackerTMGreen染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。湖南双荧光自噬慢病毒自噬既能阻止也能促进细胞凋亡,两种反应在生物体内普遍存在。
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到,其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明,对瘤子的研究尤其如此,值得关注。自噬是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的,是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
自噬和细胞周期调控都是极其动态的基本生物学过程,而自噬在细胞周期调控中的功能与分子机制还不清楚。自噬是真核生物中发现的保守降解机制,主要有自噬相关蛋白(ATG)执行自噬过程,ULK1/ATG13是较上游的自噬起始复合物。细胞周期由间期和分裂期组成;一般而言,非同步化细胞中细胞间期和分裂期时间比例是95%、5%。在非同步化细胞中,ULK1/ATG13主要受到mTORC1和AMPK磷酸化以调控自噬起始。然而,在有丝分裂期及细胞周期各阶段,ULK1/ATG13的磷酸化调控及功能尚不清楚。大自噬:由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体,然后与溶酶体融合并降解其内容物。
自噬与疾病:1、自噬与代谢:自噬能清理不正常构型的蛋白质,并消化受损和多余的细胞器,是真核细胞中普遍存在的降解/再循环系统。在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。在饥饿和新生儿早期,自噬作用明显加强,自噬体明显增多。2、自噬与**:细胞自噬与**的关系十分复杂,目前尚未完全阐明。一方面,正常细胞自噬增强,可表现出阻止**发生的功能;与此相反,阻止细胞自噬有潜在的致瘤可能。另一方面,**细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、诊治药物诱导的应激反应。线粒体自噬通过自噬降解胞内受损或多余的线粒体,是维持细胞稳态的关键机制之一。西安细胞自噬透射电镜
在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。西安细胞自噬透射电镜
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